糖類・糖質を検出する定性分析方法・判別実験

糖類 (糖質) は、多価アルコールのアルデヒドまたはケトンとして定義されます。
また、これらの生体高分子も含まれ、加水分解によって、これらの化合物が得られます。糖類 (糖質) は動物、植物、微生物にも存在し、多様な構造的および代謝的な役割を果たします。

例えば、グルコースのような糖は主要なエネルギー源の一つであり、デンプンやグリコーゲンは、それぞれ植物と動物における貯蔵多糖類として機能しています。
さらに、糖類 (糖質) は細胞壁、動物の結合組織、無脊椎動物の外骨格の構造成分でもあります。他に、糖類 (糖質) は核酸やNAD(P)やFADなどの補酵素のような重要な生体分子の成分でもあります。

糖類 (糖質) はサッカライド（砂糖を意味するギリシャ語の「Sakcharon」）とも呼ばれ、以下のように分類することができます。

1. 単糖類
これらの糖類 (糖質) は、ポリヒドロキシアルデヒドまたはケトンの単一単位であり、加水分解で、より単純な化合物に分解することはできません。
グルコース、アラビノース、リボース、フルクトース、ガラクトースなどの単純な糖が単糖類の例です。

2. オリゴ糖類
オリゴ糖類は、2～10個の単糖類（モノマー）がグリコシド結合によって互いに結びついています。
スクロース、ラクトース、マルトース、ラフィノース、スタキオースなどが例です。

3. 多糖類
多糖類は、10個以上の単糖類単位がグリコシド結合で互いに結びついて構成されています。
デンプン、グリコーゲン、セルロースなどが例です。

生物化学分析などでは、試料が糖類 (糖質) が含まれているかを確認する必要がある場面があり、特定の呈色反応を利用することがあります。
ここでは、糖類 (糖質) に関する呈色反応について、その原理や手法をまとめます。

モーリッシュ試験 (Molisch’s Test) 

モーリッシュ試験 (Molisch’s Test) はすべての糖類 (糖質) に対する一般的な検査方法です。
濃硫酸（Conc. H₂SO₄）はグリコシド結合を加水分解して単糖を生成し、酸の存在下で脱水されてフルフラールおよびその誘導体を形成します。これらの生成物はスルホン化したα-ナフトールと反応して紫色の錯体を生成します。
多糖類や糖タンパク質も陽性反応を示します。

試薬

1. 濃硫酸（Conc. H₂SO₄）
2. α-ナフトール：5% (w/v) エタノール溶液（新しく調製する）

手順

1. 試験溶液2 mLにα-ナフトール溶液を2〜3滴加える。
2. 注意を払いながら、試験管の側面に沿って濃硫酸（Conc. H₂SO₄）を1 mLゆっくりとピペットで加え、2つの異なる層が形成されるようにする。
3. 2つの層の境界で色の変化を観察します。紫色が現れた場合、糖類 (糖質) の存在を示す。

注意事項

1. α-ナフトール溶液は不安定であるため、新しく調製する必要があります。
2. 濃硫酸（Conc. H₂SO₄）は試験管の側面に沿って加え、中身の攪乱は最小限となるようにします。

アントロン試験 (Anthrone Test) 

アントロン試験 (Anthrone Test) はアントロン反応を利用した検査方法で、糖類の別の検査方法です。この反応では、生成されたフルフラールがアントロンと反応して青緑色 (青みがかった緑色) の錯体を生成します。

材料と試薬

1. 沸騰水浴
2. 濃硫酸（Conc. H₂SO₄）
3. 濃硫酸（Conc. H₂SO₄）に溶解した0.2% (w/v) アントロン溶液

手順

試験溶液を0.5～1 mLをアントロン試薬約2 mLに加え、十分に混合する。
その後、色が青緑色に変化するかどうかを観察する。
変化しない場合は、試験管を沸騰水浴に10分間保持した後、再度確認する。

ヨウ素試験 (ヨウ素デンプン反応) 

ヨウ素デンプン反応は、小学校でも理科などで取り上げられるよく知られている反応です。
ヨウ素は多糖類と色付きの吸着錯体を形成します。デンプンはヨウ素と反応して青色を呈し、グリコーゲンは赤褐色の錯体を形成します。したがって、アミラーゼ、アミロペクチン、およびグリコーゲンの検出において、有用で便利かつ迅速な検査方法となっています。

材料と試薬

1. ヨウ素溶液：3% (w/v) のヨウ化カリウム溶液に0.005 Nのヨウ素溶液を調製する。
2. グルコース、スクロース、デンプン、グリコーゲン、セルロースなどの1%試験溶液。

手順

試料抽出液または試験溶液を1 mL試験管に取る。
そこにヨウ素溶液を4〜5滴加え、内容物を優しく混合する。色付きの生成物が形成されるかどうかを観察し、その色を確認する。

バーフォード試験 (Barfoed’s Test) 

バーフォード試験は、バーフォード反応を利用した試験です。
この試験は単糖類と還元性をもつ二糖類を区別するために使用されます。単糖類は通常1〜2分で反応しますが、還元性をもつ二糖類は加水分解されて試薬と反応するまでに7〜12分と長い時間がかかります。
この試験では、酸化銅(I)の生成によりレンガ色の赤色の確認ができます。

材料と試薬

1. 沸騰水浴
2. バーフォード試薬：13.3 gの酢酸銅を200 mLの水に溶かし、氷酢酸を1.8 mL加える。

手順

試験管にバーフォード溶液を2 mL取り、試料溶液を1 mL加える。試験管を沸騰水浴に入れる。信頼性の高い結果を得るためには、勢いよく沸騰している湯浴を使用したほうがよい。
レンガ色の赤色の形成を確認し、その発色にかかる時間も記録する。

セリワノフ試験 (Seliwanoff’s Test) 

セリワノフ試験 (Seliwanoff’s Test) はセリワノフ反応を利用した検査方法です。
この試験はアルドースとケトースを区別するために使用されます。ケトースは脱水してフルフラール誘導体を生成し、これがレゾルシノールと縮合して赤色の錯体を形成します。長時間の加熱により、二糖類や他の単糖類も加水分解され、最終的に色を呈します。
セリワノフ反応の生成物の反応機構は こちら の記事も参照ください。

材料と試薬

1. 沸騰水浴
2. セリワノフ試薬：0.05% (w/v) レゾルシノールを3 N HClに溶解したもの。

手順

試験溶液1 mLをセリワノフ試薬2 mLに加え、沸騰水浴で1分間温める。濃い赤色が現れるかを確認する。

赤色の生成物が生じた場合、試料溶液がケトースを含んでいることが確認できます。

フェーリング試験 (Fehling’s Test) 

フェーリング試験はフェーリング反応を利用した試験です。
フェーリング試験は還元性をもつ糖の検出に対する特異的で、感度の高いテストです。酸化銅(I)の黄色または赤色の沈殿物の形成は還元性をもつ糖の存在を示します。
この反応では、ロッシェル塩がキレート剤として作用します。

材料と試薬

1. 沸騰水浴。
2. フェーリング溶液A：35 gのCuSO₄·5H₂Oを水に溶かし、体積を500 mLにする。
3. フェーリング溶液B：120 gのKOHと173 gの酒石酸カリウムナトリウム（ロッシェル塩）を水に溶かし、体積を500 mLにする。
4. フェーリング試薬：フェーリング溶液AとBを同量ずつ混合する。これらの溶液は使用直前に混合する必要がある。

手順

フェーリング試薬1 mLを、試験溶液1 mLに加える。十分に混合し、試験管を激しく沸騰している湯浴に置く。
酸化銅(I)の赤色沈殿の形成を確認し、これが試験溶液中に還元性をもつ糖が存在することを示す。

ベネディクト試験 (Benedict’s Test) 

ベネディクト試験はベネディクト反応を利用した試験です。
ベネディクト試験は簡便で、試薬の安定性が高いという特徴があります。この方法では、クエン酸ナトリウムがキレート剤として機能します。還元性をもつ糖が存在すると、酸化銅(I)の赤色沈殿が形成されます。

材料と試薬

1. 沸騰水浴
2. ベネディクト試薬：173 gのクエン酸ナトリウムと100 gの無水炭酸ナトリウム（Na₂CO₃）を600 mLの温水に溶かし、水で800 mLに希釈する。
3. 17.3 gのCuSO₄·5H₂Oを100 mLの温水に溶かし、冷却後100 mLに希釈する。
4. 試薬2を試薬3に撹拌しながら、ゆっくりと加える。最終的な体積を1 Lにする。

手順

試験溶液または試料抽出液を0.5～1 mLを、ベネディクト試薬（試薬4）2 mLに加える。試験管を激しく沸騰している湯浴に置く。
赤色沈殿の形成するかを観察し、その発色が起きた場合には溶液中に還元性をもつ糖類が存在することを示す。

ピクリン酸試験 (Picric Acid Test) 

この試験も還元性をもつ糖の検出のための試験です。還元性をもつ糖はピクリン酸と反応して赤色のピクラミン酸を形成します。

材料と試薬

1. 沸騰水浴
2. 飽和ピクリン酸：ピクリン酸13 gを蒸留水に溶かし、沸騰させて冷ます。
3. 10% Na₂CO₃

手順

試料溶液に飽和ピクリン酸1 mLを加え、その後に10% Na₂CO₃を0.5 mL加える。その後、試験管を沸騰水浴に置く。
赤色が現れると、試料溶液中に還元糖が存在していることを示す。

ビアル試験 (Bial’s Test)

ビアル試験はペントース糖の測定に使用され、この反応はビアル反応ともいわれます。
反応は酸性媒体中でフルフラールが生成し、フルフラールが第二鉄イオンの存在下でオルシノールと縮合して、青緑色の錯体を形成します。この錯体はブチルアルコールに溶解します。

ビアル反応については こちらの記事 も参照ください。

材料と試薬

1. 沸騰水浴
2. オルシノール1.5 gを濃塩酸100 mLに溶解し、10%塩化第二鉄溶液を20～30滴加えます。

手順

1. ビアル試薬 (オキシノール試薬ともいう) 2 mLに試験溶液を4～5滴加える。
2. 沸騰水浴で加熱する。
3. 青緑色の錯体が形成するか観察する。

粘液酸試験 (Mucic Acid Test) 

この試験はガラクトースに特異的な試験です。
この糖は濃硝酸との反応によって他の単糖と区別できるため、これを利用します。他の単糖類の酸化では可溶性のジカルボン酸が生成しますが、ガラクトースは不溶性の粘液酸 (ムチン酸) を生成します。

材料と試薬

1. 沸騰水浴
2. 固体のガラクトース
3. 固体のグルコース
4. 濃硝酸

手順

約50mgのガラクトースと約50mgのグルコースを別々の試験管に取る。各試験管に水1mLと濃硝酸1mLを加える。沸騰水浴中で1.5時間加熱し、5 mLの水を加えて一晩静置する。ガラクトースでは不溶性粘液酸が生成するが、グルコースや他の糖では生成しない。

参考文献

Katoch, Rajan, and Rajan Katoch.
"Carbohydrate estimations." Analytical Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (2011)